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色谱法能否获得满意的分离效果，关键在于色谱条件的选择及其操作的规范性，下面介绍柱色谱条件的选择及其操作规程。
1. 吸附剂的选择
常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。
选择吸附剂的首要条件是与被吸附物及展开剂均无化学作用。
吸附能力与颗粒大小有关，颗粒太粗，流速快分离效果不好，太细则流速慢，通常使用的吸附剂的颗粒大小以１00～150目为宜。
色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。
酸性氧化铝是用1％盐酸浸泡后，用蒸馏水洗至悬浮液pH为4～4.5，用于分离酸性物质；中性氧化铝pH为7.5，用于分离中性物质，应用最广；碱性氧化铝pH为9～10，用于分离生物碱、胺、碳氢化合物等。
市售的硅胶略带酸性。
吸附剂的活性与其含水量有关，含水量越高，活性越低，吸附剂的吸附能力越弱；反之则吸附能力越强。
吸附剂的含水量和活性等级关系如表210所示。
表210吸附剂的含水量和活性等级关系
活性等级ⅠⅡⅢⅣⅤ氧化铝含水量（%）０361015硅胶含水量（%）０5152538一般常用的是Ⅱ级吸附剂。
Ⅰ级吸附性太强，且易吸水；Ⅴ级吸附性太弱。
吸附剂按其相对的吸附能力可粗略分类如下。
① 强吸附剂：低含水量的氧化铝、硅胶、活性炭。
② 中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、氧化镁。
吸附剂的吸附能力不仅取决于吸附剂本身，还取决于被吸附物质的结构。
化合物的吸附性与它们的极性成正比，化合物分子中含有极性较大的基团时，吸附性也较强，以氧化铝为例，对各种化合物的吸附性按以下次序递减：
酸和碱＞醇、胺、硫醇＞酯、醛、酮＞芳香族化合物＞卤代物＞醚＞烯＞饱和烃
2. 洗脱剂的选择
在柱色谱分离中，洗脱剂的选择是至关重要的。
通常根据被分离物中各组分的极性、溶解度和吸附剂活性来考虑。
首先，洗脱剂的极性不能大于样品中各组分的极性。
否则会由于洗脱剂在固定相上被吸附，迫使样品一直保留在流动相中。
在这种情况下，组分在柱中移动的速度非常快，难以建立起分离所要达到的平衡，影响分离效果。
另外，所选择的洗脱剂必须能够将样品中各组分溶解，如果被分离的样品不溶于洗脱剂，则各组分可能会牢固地吸附在固定相上，而不随流动相移动或移动很慢。
一般洗脱剂的选择是通过薄层色谱实验来确定的（具体方法见实验12薄层色谱），哪种展开剂能将样品中各组分完全分开，即可作为柱色谱的洗脱剂。
当单纯一种展开剂达不到所要求的分离效果时，可考虑选用混合展开剂。
色谱柱的洗脱首先使用极性最小的溶剂，使最容易脱附的组分分离，然后逐渐增加洗脱剂的极性，使极性不同的化合物按极性由小到大的顺序自色谱柱中洗脱下来。
常用洗脱剂的极性及洗脱能力按如下顺序递增：
己烷和石油醚＜环己烷＜四氯化碳＜三氯乙烯＜二硫化碳＜甲苯＜苯＜二氯甲烷＜氯仿＜环己烷乙酸乙酯（80∶20）＜二氯甲烷乙醚（80∶20）＜二氯甲烷乙醚（60∶40）＜环己烷乙酸乙酯（20∶80）＜乙醚＜乙醚甲醇（99∶1）＜乙酸乙酯＜丙酮＜正丙醇＜乙醇＜甲醇＜水＜吡啶＜乙酸
极性溶剂对于洗脱极性化合物是有效的，非极性溶剂对于洗脱非极性化合物是有效的，若分离复杂组分的混合物，通常选用混合溶剂。
所用洗脱剂必须纯粹和干燥，否则会影响吸附剂的活性和分离效果。
3. 色谱柱的大小和吸附剂的用量
柱色谱的分离效果不仅依赖于吸附剂和洗脱剂的选择，而且还与色谱柱的大小和吸附剂的用量有关。
一般要求柱中吸附剂用量为待分离样品量的30～40倍，若需要时可增至100倍，柱高和直径之比一般为10∶1。
4. 装柱
装柱是柱色谱中最关键的操作，装柱的好坏直接影响分离效率。
装柱之前，先将空柱洗净干燥，然后将柱垂直固定在铁架台上。
如果色谱柱下端没有砂芯横隔，就取一小团脱脂棉或玻璃棉，用玻璃棒将其推至柱底，再在上面铺上一层厚0.5～1cm的石英砂，然后进行装柱。
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